Roy Claxton Acuff se narodil 15. září 1903 v Maynardsvillu ve státě Tennessee, v rodině babtistického pastora. I když se v dětství naučil hrát na různé hudební nástroje, byla jeho cílem kariéra hráče baseballu. Patřil mezi nejlepší hráče školního týmu a dokonce dostal předběžnou nabídku od slavných New York Yankees. Jeho sportovní kariéru však ukončila série slunečních úpalů, které ho v letech 1929 – 30 několikrát připoutaly na lůžko.
Po uzdravení se Roy naučil hrát na housle a stal se členem kočovné společnosti, se kterou koncertoval v mnoha městech ve státech Virginia a Tennessee. V roce 1933 založil Acuff vlastní skupinu The Tennessee Crackerjacks a záhy získal i vlastní vysílací čas na místní rozhlasové stanici. V roce 1936 absolvoval Roy Acuff dvě nahrávací frekvence ve studiích společnosti ARC, jejichž výsledkem byly dvě klasické nahrávky „Great Speckled Bird“ a „Wabash Cannonball.“
V roce 1938 debutoval Acuff na scéně Nashvillské Grand Ole Opry a nedlouho na to se stal pevnou součástí jejího programu. V období válečných let nahrál Acuff celou řadu dalších úspěšných snímků: „Wreck On The Highway,“ „Fireball Mail“ nebo „Low And Lonely.“ V letech 1944, 1946 a 1948 byl Acuff nominován na funkci guvernéra státu Tennessee, ale většinou neprošel ani prvním kolem. Jeho velký přínos pro country music ocenila Country Music Association, když ho v listopadu 1962 zvolila jako prvního žijícího umělce členem Country Music Hall Of Fame. V průběhu své kariéry dokázal Roy Acuff prodat více než 30 milionů desek, Mohli jsme ho také vidět v mnoha hollywoodských filmech, např.: Cowboy Canteen (1944), My Darling Clementine (1943) nebo Night Train To Memphis (1946). V době vojenského konfliktu ve Vietnamu Acuff několikrát koncertoval pro americké vojáky na frontě, za což byl 24. května 1973 v Bílém domě vyznamenán válečným křížem.
V 70. a 80. letech stále pravidelně působil v programech Grand Ole Opry, ale podstatně omezil svoji zájezdní činnost. V 90. letech se v Oprylandu objevoval už jen sporadicky. Roy Acuff zemřel po krátké nemoci 23. listopadu 1992.